واكنش ترومبوسیت جوجه های گوشتی به لیپوپلی ساكارید

مترجم: پترجمه و تنظیم :پیمان صدرزاده -منوچهر اسدی

خلاصه: تاثیر لیپوپلی ساكارید (LPS) بر آشكارسازی یاخته جنبی proinflammatory ، (IL)-1β،IL-6،IL12 در ترومبوسیت جوجه‌های گوشتی مورد ارزیابی قرار گرفت. در 4 هفتگی، نمونه‌های خون جمع‌آوری شد، و ترومبوسیت‌های جداسازی‌شده به مدت 1 ساعت در LPS خوابانده شدند. اسید ریبونوكلوئیك از سلول‌ها خارج شد تا آشكارسازی یاخته جنبی proinflammatory با استفاده از نسخه‌برداری معكوس بلادرنگ PCR مورد آزمایش قرار گیرد. كشف شد كه آشكارسازی IL-1β،IL-6،IL-12 در ترومبوسیت‌ها تحت تاثیر رژیم‌های غذایی حاوی كورتیكوسترون و ویتامین C قرار نمی‌گیرند. به هر حال، در معرض LPS قرار گرفتن باعث افزایش این سیتوكین‌ها نشد. این حقیقت كه ترومبوسیت‌ها بسیار زیاد هستند و می‌توانند توسط LPS تحریك شوند باعث می‌شود كه اولین سلول‌های موثر در میزبان طبیعی مستحكم در برابر آلودگی‌های باكتریایی جوجه ها شوند.
    
    مقدمه
    ترومبوسیت‌های جوجه‌ها، لیكوسیت‌های هسته‌دار خون هستند كه نشان‌دهنده فراوان‌ترین گونه‌های سلول‌های سفید در خون جوجه می‌باشند. از آنجایی كه مغز استخوان جوجه دارای مگاكاریوسیت نمی‌باشد، ترومبوسیت از سلول‌های تك‌هسته‌ای قبلی به وجود می‌آید. ترومبوسیت‌ها در عملكرد در برابر پلاكت‌های پستانداران همولوگ هستند. پلاكت‌ها كوچك‌ترین سلول‌های خونی هستند كه تنها باقی مانده سیتوپلاسم مگاكاریوسیت می‌باشند. پلاكت‌ها به دلیل نقش آنها در مكانیسم دفاع میزبان طبیعی در تحقیقات ایمن‌شناختی سال‌های اخیر موضوعات مرموزی بوده‌اند. پلاكت‌ها بیشتر به دلیل پروسه هموستاز و مبادرت به ترمیم زخم شناخته شده‌اند. در كنار نقش آنها در هموستاز و ایجاد ترومبوس (لخته خون) بعد از صدمه آندوتلیال، پلاكت‌ها نیز در فرآیندهای التهاب و ترمیم بافت شركت می‌كنند. پلاكت‌ها مولكول‌های فعال زیستی فراوانی از قبیل عامل شیمیوتاكسی را برای تمام سلول‌ها، پروتئین‌های كاتیونی، هیستامین، سروتونین، پروستاگلاندین E2، و پروستاگلاندین D2 را آزاد می‌كنند.
    ترومبوسیت‌های جوجه‌ها در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفته است تا آشكارسازی ژن سیتوكین‌های proinflammatory را تجزیه كنیم. جوجه‌های گوشتی تجاری می‌توانند در معرض تنش‌زاهای مختلف قرار گیرند و در محیط‌هایی كه میكروارگانیسم‌های هوایی و اجزای میكروبی سلامتی جوجه‌ها را به خطر می‌اندازند، رشد كنند. بنابراین، ترومبوسیت‌های جداشده با LPS كشت شدند تا قابلیت واكنش جوجه‌های گوشتی به این اجزای میكروبی را از طریق این گونه بی‌مانند سلول تعیین كنند.
    
    مواد و روش‌ها
    54 جوجه گوشتی كه در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفتند از جوجه‌كشی محلی گرفته شده بودند و تا 2 هفتگی رژیم استارتر دریافت كردند. برای آزمایش 2 تكرار ، 18 و 36 جوجه به طور اتفاقی به 3 گروه منصوب شدند كه از 2 هفتگی تا 4 هفتگی رژیم متفاوتی را دریافت می‌كردند و دانشگاه مورگان، كلمسون و كارولینای جنوبی نگهداری شدند. گروه‌های رژیمی، رژیم كنترل بودند (رژیم دانه استاندارد)، رژیم كنترل با 30 میلی گرم/كیلوگرم كورتیكوسترون برای تحریك تنش اكسایشی، و رژیم كنترل با 30 میلی گرم/ كیلوگرم كورتیكوسترون به اضافه 500 میلی گرم/ كیلوگرم ویتامین C.
    نمونه‌های خون از رگ بال به همراه 10 درصد EDTA به عنوان ماده ضدانعقاد خون درون سرنگ‌ها جمع‌آوری شدند تا ترومبوسیت جداسازی شود. خون جمع‌آوری‌شده بر روی یخ انباشته شد تا به آزمایشگاه منتقل شود. پروتوكل جداسازی ترومبوسیت مورد استفاده در اینجا مدل تغییر یافته پروتكل مورد استفاده توسط هوریوشی و همكارانش بود. نمونه‌های خون با محلول نمك فاقد CA+2 و Mg+2 رقیق شدند. نمونه‌های رقیق‌شده خون بر روی واسطه جداسازی لنفوسیت طبقه‌بندی و در 1700× g به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شد. باندهای حاوی ترومبوسیت جمع‌آوری شدند، دو بار شسته شدند ، مجددا در محلول نمك متعادل هنك معلق شدند. رنگ آبی تریپن برای كیفیت‌یابی تعداد سلول‌های زنده در هماسیتومتر (دستگاه شمارش گویچه‌های خون) مورد استفاده قرار می‌گیرد. غلظت سلول در محیط كشت شیشه‌ای در حدود 1×107میلی‌لیتر می‌باشد. ترومبوسیت‌ها در 10 میكروگرم از مینه سوتا سالمونلای خالص LPS بر روی سكوی نوسان‌دار در دمای 40 درجه سانتی‌گراد خوابانده شدند.
    بعد از تحریك ترومبوسیت‌ها، سلول‌ها در 5000×g به مدت 2 دقیقه تا پلاكت شدن سانتریفیوژ شدند. پلاكت‌ها در طول شب در 100 میكرولیتر از RNA و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد ذخیره شدند. بعد از 24 ساعت، سلول‌ها مجددا سانتریفیوژ شدند تا مواد شناور آنها گرفته شود و در دمای 20- درجه سانتی‌گراد برای استفاده‌های بعدی ذخیره شدند. كیت RNeasy مورد استفاده قرار گرفت، و از پروتكل‌سازنده پیروی شد تا كل RNA را از این نمونه‌ها جدا كنند و توسط درمان DNase، هر DNA ژنی را خارج كردند.
    نسخه‌برداری معكوس بلادرنگ PCR (RT-PCR ) با استفاده از كیت Quanti Tech SYBR Green RT-PCR انجام شد. آماده‌سازهای مورد استفاده در افزایش دهیدروژناز گلیسرالدئید 3- فسفات از تكنولوژی‌های پیوسته DNA به دست می‌آید. تركیب RT-PCR شامل 25/0 میكرولیتر از مخلوط QuantiTect RT، 5/12 میكرولیتر از مخلوط QuantiTect SYBR Green RT-PCR ×2 ، 5/0 میكرولیتر از هر آماده‌ساز خاص، 10 میكرولیتر از RNA الگو و 25/1 میكرولیتر از آب بدون RNase می‌باشد تا حجم واكنش نهایی 25 میكرولیتر به دست آید. سابقه نوسان مورد استفاده در تمام واكنش‌ها، 1 چرخه 50 درجه سانتی‌گرادی به مدت 30 دقیقه ، 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه، و 40 چرخه 94 درجه سانتی‌گرادی به مدت 15 ثانیه ، 57 درجه سانتی‌گراد به مدت 20 ثانیه و 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 20 ثانیه می‌باشد. كیفیت‌ساز نسبی سطوح mRNA با استفاده از محاسبه تغییر گروه در طول Pfaffl می‌باشد.
    آزمایش كارخانه‌ای با استفاده از طرح كرت‌های شكافته شده در مورد جوجه‌های گوشتی انجام شد تا تكرارها را برای هر یك از 3 رژیم در آزمایش تكرار شده، مشخص كند. نمونه‌های خون جمع‌آوری‌شده از هر جوجه گوشتی به 2 قسمت تقسیم شد كه یك قسمت به عنوان كنترل عمل می‌كرد و قسمت دیگر توسط LPS تحریك می‌شد. تجزیه واریانس‌ها توسط روش GLM انجام شد و فرضیه‌های آزمایش با استفاده از α=0.05 اجرا شد.
    
    نتایج و بحث‌ها
    رژیم‌ها بر آشكارسازی سیتوكین‌های پرالتهاب تاثیر نمی‌گذارد، اما تحریك LPS باعث افزایش سطح آشكارسازی در مقایسه با ترومبوسیت‌های كنترل عمل نیامده شد. (شكل 1). از این شكل مشخص است كه آشكارسازی نسبی تكرار در مورد IL-1β ، IL-6، و IL-12 افزایش می‌یابد. بیشترین آشكارسازی مشاهده‌شده در تغییر تكرار نسبی IL-6 بود. Interleukin-1β دارای آشكارسازی واضح بود اما درجات تغییر پائین‌تری نسبت به IL-6 داشت. Interleukin-12 در مقایسه با 2 سیتوكین پرالتهاب دیگر به طور متوسط تحریك شد، اما تغییر تكرار آن نیز مشخص بود.
    لیپوپلی ساكارید بر عملكرد سلول تاثیر می‌گذارد و آشكارسازی ژن را در مونوسیت، ماكروفاژ و هتروفیل جوجه القاء می‌كند. در حقیقت، ما در این تحقیق نشان داده‌ایم كه LPS باعث القای آشكارسازی سیتوكین‌های التهاب‌دار IL-1β، IL-6، IL-12 در ترومبوسیت‌های شبیه به هتروفیل می‌شود، سلول‌های موثر اولیه میزبان فطری با آلودگی باكتریایی در ماكیان‌ها مقابله می‌كند. هتروفیل‌ها معادل مرغی نوتروفیل هستند و به عنوان فاگوسیت متخصص عمل می‌كنند تا به تنظیم دفاع میزبان فطری كمك كنند. هتروفیل جوجه به طور اساسی دارای گیرنده Toll-like (TLR ) 10/6/1، گونه 1 TLR2، گونه 2 TLR2، TLR3، TLR4، TLR5 و TLR7 می‌باشند. آزمایشگاه ما اخیرا نشان داده است كه ترومبوسیت، TLR2، TLR3، TLR4، TLR5 و TLR7 آشكار می‌سازد. بنابراین، تاثیر LPS مشاهده شده بر روی ترومبوسیت جوجه‌های گوشتی دارای نقش مهمی در هموستاز پلاكت‌های پستانداران می‌باشد. همچنین نشان داده شده است كه ترومبوسیتها، پروتئین‌های آنتی هپارین ترشح می‌كنند. اما تا این زمان، هیچ تحقیقی در مورد ترومبوسیت‌هایی كه دارای توانایی در سلول‌های ایمنی می باشند، انجام نشده است. اكتشافات این تحقیق، همراه با سایر اطلاعات آزمایشگاه ما، نشان می‌دهد كه ترومبوسیت‌ها می‌توانند TLR آزاد كنند كه باعث می‌شود ترومبوسیت‌ها به عنوان سلول‌های موثر اولیه شناخته شوند.
    ترومبوسیت‌ها فراوان‌ترین سلول‌های سفید خون در خون ماكیان می‌باشند و در جریان آنها مقدار ترومبوسیت‌ها 6 برابر بیشتر از تعداد هتروفیل‌ها می‌باشد. این موضوع نشان می‌دهد كه اگرچه ترومبوسیت‌ها و هتروفیل‌ها دارای عمكرد سلول‌های موثر مشابهی در مقابله میزبان ذاتی با آلودگی‌های باكتریایی هستند، ترومبوسیت‌ها با تعداد محدود می‌توانند سلولهای موثر اولیه جوجه‌ها باشند.
    پیمان صدرزاده - كارشناس مدیریت بانك كشاورزی استان آذربایجان غربی
    منوچهر اسدی- كارشناس مدیریت بانك كشاورزی آذربایجان غربی